Manuel  Mateus  Ventura
Brasília, Distrito Federal, Brasil
www.manuelmateusventura.pro.br

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    | C o n f e r ê n c i a s |
   
  
   

CATÁLISE  ENZIMÁTICA : presente e futuro.

Alguns destaques na evolução da Enzimologia.

Por   Manuel Mateus Ventura
venturamm@unb.br


O início

Pasteur mostrou que as fermentações, conhecidas como práticas artesanais para obtenção de certos produtos como bebidas alcoólicas e vinagre, estavam associadas à presença  de microorganismos. O trabalho pioneiro de Eduard  Büchner (laureado com o prêmio Nobel de 1907)(1), feito ao final do século XIX e publicado em 1897 nos “Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft”, ao mostrar que fermentações não passavam   de     ações puramente químicas que podíam   oicorrer  em meios livres de células, conduziu ao surgimento da enzimologia – o estudo  das enzimas, os  agentes químicos responsáveis por essas ações fermentativas  .

O trabalho de Büchner e o de Wöhler, este de 1828 e reportando a síntese da uréia por termoisomerização do isocianato de amônio, são marcos na linha de esforços dos químicos no sentido de descrever e interpretar em termos de química as transformações que ocorrem na célula viva, vencendo, assim, a resistência vitalista de boa parte do pensamento corrente da época. Os sistemas vivos deixavam de ser intratáveis pelas leis universais das ciências físicas, para serem considerados como “sistemas altamente estruturados obedecendo às leis da dinâmica química, no expressar de Lotka, em seus Elements of Physical Biology (1924)¨ (2) ..
Delineara-se, assim, o surgimento da Bioquímica e da Biofísica Molecular.

Enzimas como  proteínas catalíticas

A identificação subseqüente das ensinas como proteínas dotadas de ação catalítica fez com que o avanço da Enzimologia se fizesse imbricado com a da ciência das proteínas e constituísse o grosso das atividades em Bio -. química  ao  mesmo  tempo  em  que  enzimas  eram  isoladas,  purificadas,  cristalizadas   e caracterizadas. A identificação de substratos, inibidores, ativadores e intermediários metabólicos conduzia à definição das miríades de rotas ou vias me metabólicas, cujo conjunto é hoje denominado de metaboloma, seguindo a tendência da nomenclatura atual em usar a desinência oma para designar grupos de espécies e/ou ações moleculares que, na célula, apresentam similaridade (genoma, proteoma, transcriptoma, metiloma, etc.).

Esta foi à fase de índole acentuadamente reducionista da bioquímica, cujos conceitos, métodos e resultados foram apresentados em um marco da literatura bioquímica – o “Enzymes” de Haldane, publicado em 1930.

Pela disrupção das células, tornando seu conteúdo accessível aos procedimentos de isolamento e de análise, a enzimologia pôde avançar e constituir, sem dúvida, o corpo principal da bioquímica. O rompimento de órgãos, tecidos e células, como a etapa inicial das atividades em enzimologia,   incomodava   aos   biólogos   mais conservadores, pois, o bioquímico ,  alegavam eles , destruía a organização biológica característica do que era vivo, logo ao iniciar seu trabalho. Entretanto, era óbvio, não havia outro meio de estudar as enzimas e tudo mais relativo à estrutura e função dos sistemas vivos, em nível mais fundamental – o nível atômico – molecular.

As descrições fisiológicas, conquanto  válidas  em  seu   nível  próprio  de  descrição,  não  incluiam  aspetos mecanísticos, eram “caixas pretas.” , as quais a  bioquímica e  a  biofísica   transformam    em “caixas brancas”, para usar denominações do agrado das ciberneticistas.

Reunião e revisão do conhecimento enzimológico

Duas obras monumentais reúnem e constituem a fonte do conhecimento enzimológico de hoje:

The Enzymes, em vários volumes, editado por  Boyer e outros;

Methods in Enzymology, a mais extensa obra de que se tem notícia relativamente a um domínio de conhecimento. Anualmente, continua sendo acrescida por novos volumes, os quais, como sabemos, são ansiosamente aguardados pela comunidade bioquímica.

Advances in Enzymology e Advances in Protein Chemistry são, igualmente, úteis publicações que, sob a forma de revisões, reúnem tópicos de destaque da Enzimologia e da Ciência das Proteínas.

-Bases de dados na WEB

Visão integrativa
Apesar de sua abordagem essencialmente analítica no estudo do arsenal catalítico da célula viva, os bioquímicos, e particularmente os enzimologistas, nunca ignoraram a necessidade de, após os estudos in vitro,  retornarem  ao interior da célula para o estudo das enzimas de forma integrativa, ao seguir suas ações nas redes metabólicas, sob mecanismos de controle de origem genômica e de sinalização interna e externa.
Vale lembrar a declaração de Haldane, um dos fundadores da Enzimologia, que sempre valeu como um alerta aos bioquímicos:

            “A célula não é um saco de enzimas".

Assim, por mais reducionistas que tivessem sido em seu trabalho, os  enzimologistos sempre tiveram presente a idéia integrativa das ações enzimáticas para entendimento das ações celulares e organísmicas.
Podemos dizer que esta é a tônica da bioquímica e biofísica contemporâneas. Alguns se referem a uma era pós-reducionista.
A enzimologia situa-se na interface Ciência da vida / Ciências moleculares, recebendo da química e da física conceitos , recursos teóricos e instrumentais que lhe possibilitam consistência teórica e riqueza metodológica que a permitem alcançar suas metas fundamentais e de práxis. A tecnologia enzimática, o tema central deste seminário, é a expressão tecnocientífica desse domínio de conhecimento.

Purificação e cristalização de enzimas

Para os estudos de caracterização das enzimas são necessárias quantidades razoáveis destas proteínas, da ordem de algumas dezenas de miligramas, por exemplo.

Isto foi conseguido inicialmente por Summer que cristalizou urease a  partir de sementes de feijão – de – porco     (Cannavalia ensiformus) .

A seguir, Northrop e Kunitz cristalizaram pepsina, trypsina e quimotripsina.

A caracterização dessas enzimas fortaleceu a idéia de que enzimas são proteínas catalíticas.

A cristalização de uma proteína como critério de pureza cedeu lugar, por não ser totalmente confiável, ao uso das técnicas eletroforéticas em gel, de alto poder resolvente, como será visto mais adiante.
Porém, a cristalização de proteínas é sempre desejável, após suas purificações serem levadas ao mais alto grau, visando-se o estudo das estruturas por técnicas cristalográficas, como será referido mais à frente.

Durante a primeira metade de século passado, o “salting out” ou relargagem salina era a técnica quase exclusiva no fracionamento e isolamento de proteínas a partir dos extratos salinos de fontes de origem vegetal ou animal. As proteínas séricas foram isoladas principalmente, por “salting-out”. Dessa época,  vêm os termos albumina   e globulima, atribuídos a proteínas com base em seu comportamento frente a soluções salimas e ainda hoje usados.

O surgimento das técnicas cromatográficas em coluna, usando permutadores de íons (celuloses modificados e resinas sintéticas) e géis para a filtração- em- gel ( cromatografia – por – exclusão de tamanho), é o marco de um avanço extraordinário na metodologia de fracionamento e isolamento de proteínas e, dentre estas, enzimas, mais particularmente.

A eletroforese em gel de poliacrilamida(PAGE), em escala analítica ou preparativa, é ainda uma ferramenta de uso quase obrigatório em química de proteínas.

A composição em aminoácidos de proteínas purificadas tornou-se rotina por cromatografia de permuta iônica, como resultado do magistral trabalho de Stein e Moore que lhes valeu o prémio Nobel.

Tanto para fins de análise e preparação, a química de proteínas contemporânea conta com a cromatografia líquida de alta performance(LCHP), como ferramenta altamente eficaz.

Proteínas purificadas têm sido clivadas por ação de proteases de várias especificidades e os peptídeos resultantes separados por técnicas cromatográficas e eletroforéticas. Mapas peptídicos por cromatografia – em – gel bidimensional mostram alta resolução e têm importância na identificação de proteínas e na obtenção de peptídeos para ulterior sequenciamento de aminoácidos.

O sequenciamento dos peptídeos, iniciado pelo trabalho de Sanger, é hoje feito por técnicas cromatográficas em fase gasosa, automáticas, e, cada vez com maior freqüência, por espectrometria – de  - massa,uma metodologia que se vem mostrando de grandes recursos em química de proteínas. Hoje – em – dia, dezenas de milhares de seqüências de proteínas, das quais grande parte é de ensimas, estão disponíveis em bases – de- dados, na WEB, juntamente com eficientes ferramentas de software que permitem alinhamentos múltiplos construção de árvores filogenéticas e comparações para definição de domínios conservados e outras operações tornadas possíveis pela crescente metodologia bioinformática. Todo esse acervo informacional está disponível aos pesquisadores, usando microcomputadores ou “workstations”, em seus gabinetes de trabalho ou em suas residências.

A publicação de seqüências de proteínas veio a tornar-se tão rotineiro que se deslocou para periódicos de menor índice de impacto, ou simplesmente depositadas as seqüências em bases de dados. Desde que o sequenciamento de DNA é mais simples do que o de proteínas, a seqüência de um  gene estrutural pode ser traduzida e dar uma primeira informação sobre a  seqüência da proteína por ele codificado. E claro que isto não dá conta de modificações pós e co-traducionais, as quais são por vezes cruciais para o funcionalidade da proteína.

Christian Anfinsen e colaboradores, na década de 50, mostraram que a seqüência de aminoácidos de uma proteína possui toda a informação necessária ao dobramento da proteína em sua estrutura tridimensional nativa, funcional, A enzima ribonuclease foi totalmente desenrolada à sua estrutura desnaturada inativa, inclusive com suas ligações-dissulfeto rompidas, e, a seguir, re-enrolada e sua atividade restaurada.
Entretanto, ir da seqüência à estrutura nativa, tridimensional, isto é, conhecer o chamado 2º código, é um grande problema e de solução ainda remota, apesar dos grandes esforços despendidas por mentes brilhantes, nos dias de hoje.

A funcionalidade das proteínas decorre de suas estruturas terciárias ou tridimensionais. O problema biológico central do reconhecimento entre moléculas, proteína – proteína, proteína – ácido nucléico, enzima – substratos, coenzimas, inibidores e ativadores,  enfim,  proteína – ligantes  é,  essencialmente, um problema de complementaridade entre as regiões de contato, onde ocorrem as interações de ligação, como já vimos atrás.

Em virtude da plasticidade estrutural das proteínas, as interações nas superfícies de contato não se restringem aos resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos, mas podem propagar-se a regiões afastadas das sedes – de – ligação. Estas transconformações, chamadas de transições alostéricas,  explicam modificações e regulações alostéricas em enzimas.

Muitas proteínas apresentam estrutura quaternária , a qual consiste na associação de sub-unidades, isto é, na formação de oligômeros. Em alguns casos, sedes – de – ligação  resultam de dimerizações, sendo formadas por resíduos de aminoácidos pertencentes às duas sub-unidades associadas.

Vemos, assim, que a grande meta a ser alcançada no estudo de proteínas,  inclusive o subconjunto das enzimas, é o conhecimento de suas estruturas, em nível atômico , suas funções e, consequentemente, as relações estrutura – função, as quais, à medida que se tornam conhecidas, formam a base que torna possível modificar  deliberada - mente suas estruturas para modificar ou mesmo  criar novas propriedades.

Esquematicamente, no estado atual da ciência das proteínas, o estudo estrutural de uma proteína segue, geral -
mente, as seguintes etapas :
Estrutura primária, usando-se cada vez mais espetrometria – de – massa;
Estrutura secundária, via espetrometria dicroíca (dicroísmo circular) e espectrometria infravermelha com transformada de Fourier (FTIR);
Estrutura terciária ou tridimensional estudada por cristalografia de raio – X, e/ou , em solução, por ressonância magnética nuclear (NMR) .

 Cristalografia de raio - X

   Cristalografia de raio-X  consiste no estudo difratométrico de cristais de proteína , os quais devem ser bem formados e de tamanho adequado . Nesta  poderosa metodologia, a cristalização da proteína é a etapa limitante em termos de tempo e sucesso, apesar de sua crescente automação . Algumas proteínas são de difícil ou mesmo impossível cristalização .
Em casos especiais, a difração de neutrons , em lugar da  de raio – X, é usada para  serem obtidas as  posições dos átomos de H, o que não é possível com raio – X.
O uso recente de linhas de radiação- X de alta intensidade em laboratórios de luz síncrotron está contribuindo para aperfeiçoar a obtenção de dados de difração , os quais são processados em linha com computadores digitais até os mapas de densidade eletrônica , á modelagem final e  ao refinamento dos modelos obtidos, podendo seguir-se a  avaliação da qualidade destes e deposição em banco de estruturas ( PDB ) .
Recentemente (NATURE,  10 JAN 2002), estão sendo  usados  lasers de eletron livre ( FEL),  para emissão de pulsos breves e intensos de raio – X que  seriam muito mais eficazes do que  a radiação do síncrotron em explorar a estrutura de macromoléculas biológicas, em nível atômico. Espera-se, para os próximos anos, lasers de eletron livre que produzam pulsos de raio – X  milhões de vezes mais intensos do que os emitidos pelas fontes já em uso.
O revolucionário é que, com esses pulsos rápidos e muito intensos de raio – X, seria possível determinar a estrutura de biomacromolécular individuais (“single  molecules”) ou de pequeno número delas  .
O estudo de moléculas individuais ou isoladas teria, entre outras vantagens, a de ter a molécula livre dos constrangimentos que ocorrem em um cristal.
Esses estudos estão baseados em dois grandes centros:

- Centro de Pesquisa em Física de Altas – Energias da Alemanha, Hamburgo;
- Centro do Acelerador Lineais de S’tanford (SLAC), California ( www.slac.stanford.edu ) .

 Referindo-nos aos métodos de cristalografia de raio – X -  sem dúvida o maior destaque na ciência   das  proteínas ou, de um modo mais amplo, na biologia estrutural, não podemos deixar de falar, mesmo de passagem, do trabalho pioneiro dos que deram partida a esse domínio de conhecimento.

Toda a cristalografia de raio – X, como a temos hoje, originou-se no Laboratório  Cavendish , Cambridge, Inglaterra, quando, em1934, J.D. Bernal e Doroth Crowfoot (mais trade Hodgkin), surpreendentemente obtiveram um padrão de difração ao fazerem incidir um feixe de raio – X sobre um cristal de pepsina. Este resultado opunha-se ao ponto de vista de que as proteínas eram colóides de estrutura  amorfa, aleatória. Este modo de ver a estrutura das proteínas era defendido pela prestigiosa escola alemã de química orgânica liderada por Willstätter.

Ao trabalho de Bernal e Crowfoot  seguiram-se, ainda no Laboratório Cristalográfico de Cambridge, os estudos de Max Perutz e John Kendrew, sobre a estrutura por difração de raio-X da hemoglobina e mioglobina, respetivamente.

Após um contato com Haurowitz, em Praga, em fins de 1931 e após receber de Adair cristais de hemoglobina e ter recebido de Bernal e Fankuchen as primeiras lições sobre como obter padrões de difração de raio – X, Perutz deu partida ao seu épico e seminal trabalho sobre a estrutura molecular da hemoglobina, em Cambridge.
No início de 1938, publicou com Bernal, Fankuchen, em Nature [141 (1938) 523], um trabalho sobre difração de raio – X de cristais de hemoglobina e quimotripsina.
Perutz e Kendrew(3)  repartiram o prêmio Nobel de 1962.
Kendrew, a quem tive o prazer de conhecer pessoalmente em uma reunião no Instituto de Biofísica, UFRJ, faleceu em 1997, aos 80 anos.
Perutz faleceu em fevereiro passado, aos 87 anos (4) .
Perutz ocupou-se do estudo da hemoglobina por praticamente toda a sua vida científica, desde seu primeiro e
magistral trabalho sobre a estrutura tridimensional dessa proteína (5) . A hemoglobina, como se sabe, é uma hemoproteína tetramérica que transporta oxigênio dos pulmões aos músculos , onde, então, é estocado em li-
gação com mioglobina . Além disso, toma parte no transporte de CO2 e na regulação do pH sangüíneo. Seu
mecanismo regulador da ligação e dissociação de oxigênio é um dos primeiros casos de alosteria a ser estudado.
Apesar de não ser uma enzima, hemoglobina foi considerada por Wyman como uma ´enzima honorária ´, por serem suas características regulatórias, basucamente. apresentadas em enzimas alostéricas .
As mais de 15000 estruturas cristalográficas de proteínas depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB),  o qual é continuamente acrescido, são um monumento a todos os cristalógrafos que contribuíram e contribuem com o seu trabalho e que são portadores do espírito dos que começaram no laboratório de cristalografia de Cambridge – o berço da Biologia Molecular.

 Ressonância magnética nuclear ( RMN )

 Pequenas e médias proteínas, quando refratárias  à  cristalização, têm tido suas estruturas tridimensionais estudadas por ressonância magnética nuclear, em solução . Esta poderosa metodologia tem sido de extraordinária importância no estudo da estrutura de moléculas orgânicas , inclusive macromoléculas de interesse biológico , com peptídeos, proteínas ( pequenas ou de tamanho médio ) e ácidos nucleicos. As limitações decorrentes do tamanho da proteína vêm sendo afastadas com aperfeiçoamentos técnicos e novas estratégias metodológicas .  Estudos de dinãmica molecular têm sido feitos  com essa ténica, contribuindo para esclarecer importantes aspetos da relação estrutura-função .
Ao serem superadas as limitações instrumentais, pricipalmente pelo uso de supercondutores , permitindo obter fortes campos magnéticos , e a perspectiva de desenvovimento de avançados sistemas de detecção,  RMN de biomacromoléculas tornou-se possível .e torna-se cada vez mais potente.

Proteômica : técnicas de larga escala ( ´´ high throughput´´)

Por força dos projetos de genômica funcional e de proteômica,  as  técnicas estão sendo ajustadas no sentido de darem conta de grande número de amostras, ao mesmo tempo que os resultados obtidos são processados e interpretados em forma integrada, passando a constituir o acervo de grandes bases – de – dados, acessáveis na rede mundial de informação por adequadas ferramentas software.
Esses dados estão servindo a importantes projetos nas áreas das tecnologias enzimática, médico – farmacêutica e agrária, com a idéia de “high threoughput”, i.e. ,de larga  escala , para  permitir  resultados  em volume e tempo adequados .
Ainda nesse sentido, tem-se a destacar a “hifenação´´ de técnicas analíticas, ou seja, o uso de duas ou mais técnicas em sucessão. Cromatografia líquida  seguida , em linha,  de  espectrometria – de massa, por exemplo.

Catálise enzimática

A idéia de que a ação enzimática envolve a etapa inicial de formação de um complexo enzima – substrato, introduzida ao início do século XX por Henri e Brown, tornou-se central em enzimologia, passando a ser básica nos modelos cinéticos e em  considerações mecanísticas.

A corrente de pensamento que admitia  a ligação do substrato, efectores  e  modificadores restrita a uma região delimitada da enzima – o centro ativo, com interações limitadas aos resíduos e grupos específicos a que se ligam (as sedes de ligação) ou são diretamente envolvidos  na ação catalítica (sedes catalíticas), cedeu lugar a tentativas de interpretação mais dinâmica .
Aquela visão estática foi ilustrada pelo clássico modêlo da “fechadura-e- chave”  de Emil Fischer para representar o reconhecimento e o encaixe seletivo na interação enzima – substrativo,  dos   quais resulta a formação do complexo ES .

Enzima como uma molécula dinâmica

Essa complementaridade perfeita entre o centro ativo da enzima e o substrato, como se fosse uma peça a encaixar-se em um quebra-capeça,  foi considerada menos rigida por Koshland, ao propor seu modelo de “induced fit”, isto é, mesmo que a conformação do centro ativo não preexista como perfeitamente complementar do substrato, este, ao interagir com a enzima, pode induzir modificações conformacionais que orientem adequadamente os grupos de ligação e catalíticos com relação ao substrato. Então, o substrato pode moldar sua sede, interagindo  com   os    grupos específicos do centro ativo, de modo a   otinizar seu encaixe. Além disso, as modificações conformacionais, isto é, os movimentos ou deslocamentos de átomos   ou   grupos   atômicos determinados pela interação com o substrato ou modificadores, podem propagar-se através da matriz proteica e influenciar pontos afastados do centro ativo. Isto é tornado possível pala plasticidade da molécula de proteína,    resultando  em movimentos relativos de grupos atômicos e cadeias laterais dos resíduos .
A visualização da estrutura de uma proteína a partir das coordenadas de seus átomos as quais foram obtidas por cristalografia de raio – X, é um instantâneo, não refletindo a natureza dinâmica da molécula real.
A idéia de uma molécula de proteína dinâmica, flutuante, com movimentos internos,   tem   sido fortalecida por um corpo de dados experimentais desde Lindeström – Lang (1954), com os primeiros trabalhos sobre a permuta de   H/D   em soluções aquosas de proteínas..

A molécula de proteína como uma população de confórmeros

Nos últimos dois anos, usando coleções combinatoriais de ligantes, tem sido observado, surpreendentemente, que proteínas de especificidade não muito restrita podem ligar-se, por vezes com maior afinidade, a ligantes que diferem, em composição, tamanho e forma, dos seus ligantes naturais.
Esta multiplicidade de ligantes para uma mesma sede de ligação está sendo explicada vendo   a molécula de proteína como uma população de confórmeros de energias livres próximos uma da outra e em torno do estado nativo. Esses confórmeros são supostos em equilíbrio, o qual pode ser deslocado por fatores físico-químicos do meio e/ou por interação com ligantes.
Assim, se um dos confórmero tiver maior afinidade por um determinado ligante, o equilíbrio será deslocado em favor desse confórmero, com o conseqüente aumento de concentração do complexo correspondente. A sede para um ligante já existiria em um confórmero na população típica da proteína considerada. Lembraria, aproximadamente, o que ocorre no reconhecimento e interação antígeno – anticorpo, O anticorpo adequado ao antígeno preexiste e sua ligação ao antígeno determina a biossíntese desse antícorpo, no  mecanismo descrito pela teoria da seleção clomal.

A consideração de proteínas, em particular enzimas, como sistemas moleculares altamente dinâmicos, é o pensamento hoje dominante em ciência das proteínas.

Entretanto, os estudos experimentais sobre dinâmica de proteínas são de realização difícil, exigindo técnicas, geralmente espectrométricas, inclusive as de cinética ultra-rápida ( de nano a femtossegundo )  que flagrem, não só eventos locais como globais da molécula em estudo.

A ampla escala- de- tempo

As simulações com auxílio de computador encontram dificuldade na larga  faixa  de  variação da escala de tempo dos eventos envolvidos, na faixa de picossegundo a segundo. As simulações de dinâmica molecular, mesmo com o auxílio de computadores poderosos, têm alcançado apenas centenas de nanossegundos e, excpecionalmente um microssegundo, neste caso para uma molécula relativamente pequena. Isso fica longe  d o que  seria  necessário  para  simular  o  dobramento  e os movimentos de regiões ou domínios de proteínas.
Estão sendo feitos esforços para fortalecer   o   arcabouço   teórico   que   servirá   de   base   à interpretação das situações e dos resultados experimentais sobre a dinâmica molecular,   o   que constitui a  essência da expressão funcional de proteínas e, em particular, de enzimas.

O estado-de-transição

A teoria de processos que evoluem no tempo, isto é, caracterizados por uma cinética – os “ rate processes”, que, apesar de desenvolvida inicialmente para sistemas reacionantes em fase gasosa (teoria das velocidades absolutas de reação), foi estendida a precessos em  fase  condensada, a despeito das dificuldades encontradas pelos teóricos. Esta teoria, desenvolvida por Eyring e outros na década de 30, no século passado, admite, como idéia básica, que uma reação química passa em seu curso, necessariamente pela formação de um agregado molecular dos reagentes – o chamado estado- de- transição. Neste estado, as espécies moleculares interagentes são estruturalmente distorcidas, possibilitando o rompimento e a formação de novas ligações covalentes, dando lugar,  assim,  à conversão em produtos da reação.
O estado – de – transição é um estado de alta energia livre (Gibbs) – a energia de ativação, uma barreira de energia a ser ultrapassada para que ocorra a conversão de reagentes em produtos. Mais alta a  energia livre de ativação, menor será a probabilidade do sistema evoluir de reagentes a produtos e, portanto, mais lenta a reação. São tais barreiras de energia responsáveis pela maior ou menor estabilidade das moléculas.
Os agentes que estabilizam o estado – de – transição, o que ocorre por abaixamento de sua energia livre com relação aos reagentes, aceleram as respetivas reações. Se tais agentes são regenerados ao fim da reação, são então chamados de catalisadores. Os catalisadores exercem sua ação por formação de um complexo com os reagentes no estado de transição. De passagem, é oportuno lembrar que o estado – de transição em reações enzimáticas não é o complexo enzima – substrato, tipo Michaelis – Menten. O estado- de- transição, ES* , de muito breve tempo de vida,   segue-se   ao complexo enzima-substrato , ES .
  A  teoria dos “rate processes” constitui a base cinética da biologia molecular (Eyring   e   outros, 1954), tomada esta em sentido amplo – a  do entendimento da estrutura e função dos biossistemas em nível atômico – molecular.
  Parece claro que a proximidade e orientação dos  grupos   atômicos   envolvidos   em   reações intramoleculares ou enzimáticas são fatores que contribuem  para o aumento de velocidade de re -
ação, relativamente aos processos onde essas condições não ocorrem.
   Na formação  do complexo  enzima-substrato, ES , há redução entrópica  por conta da imobi=  lização do substrato  no centro ativo, i.e., por diminuição dos graus de liberdade do substrato.
Em alguns casos, o alojamento do substrato no centro ativo resulta na expulsão de moléculas  de
água para o corpo do solvente, onde assumem  estado mais desordenado .Neste caso,   tem-se  aumento entrópico , resultando um processo promovido ou impulsionado por entropia, se a magni-  tude  do termo entrópico da  energia livre de Gibbs  for maior do que o termo entálpico (positivo).
    O estado de transição resulta do complexo  ES  por distorção  da geometria do substrato e da
enzima, a qual resulta no rompimento e formação de ligações covalentes, o que leva à formação  de
produtos  e à regeneração da enzima, no ciclo da reação .
A interação do substrato  S  com  a enzima  E  no estado-de-transição , i.e., a interação de S* e E  para formar  ES* , resulta em  decréscima de entalpia e os efeitos entrópicos  são de tal magnitude
que se tem abaixamento da energia livre e  estabilixação do complexo ES* .
A teoria dos ´´rate processes´´ constitui  a  base  cinética  da  biologia  molecular  (Eyring e outros, 1954),  tomada esta em seu sentido amplo - o do entendimento da estrutura e função dos biossis -
temas , em nível atômico-molecular (11)..

A  proposta  de  Pauling

   Pauling, em 1946, propôs que uma enzima  é  tanyo mais eficiente   como   catalisador,   quanto ligar-se mais fortemente ao substrato no estado-de-transição ( S* )  do que ao substrato livre ( S ),  o que corresponde a uma complementaridade estrutural  entre as sedes de ligação da enzima e  S*. Disto resulta  a estabilização do estado-de-transição, com abaixamento da energia de ativação (12, 13) . Esta idéia tem dominado a  enzimologia e é central  na evolução, modificaão  e  na  criação de  novas enzimas . O conceito de complementaridade entre enzima e substrato no estado-de-transi -
ção , apesar de proposto por Pauling (1946) , foi introduzido  por Haldane, já em 1930 .
Em catálise enzimática, como na catálise em geral, a energia de ligação  enzima-substrato é usada,
em grande parte,  para estalilizar o  estado-de-transução . A parcela nrgativa de energia livre resul-  tante das modificações geométricas, quando do melhor ajuste do estado-de-transição ,  reflete-se   em  aumento  da  constante catalítica , kcat , A energia de ligação entre a enzima e o substrato livre  reflete-se  no valor da contante de Michaelis  ( KM ) , que é, com se sabe, a contante de dissocia -  ção do complexo  ES , sob determinadas condições . As enzimas evoluem no sentido de aumentar  KM , i.e, no sentido de uma maior dissociabilidade do complexo enzima-substrato , o que se opõe  ao que geralmente é aceito , que uma ligação mais forte entre enzima e substrato seria mais favorá-  vel  à catálise .
     A  utilização, na catálise enzimática,  da energia de ligação entre enzima e substrato,  tem  sido     evidenciada  por via experimental, principalmente na cinética  de serino-proteases .O centro centro  ativo  destas enzimas apresenta  várias sedes de ligação  para resíduos específicos  da cadeia poli-  peptídica do substrato .  É  mostrado que  a energia de ligação  entre  E  e  S  é usada em aumen-  tar a constante de especificidade  ,  kcat / KM ,  por acréscimo de  kcat , como conseqüência   da    melhor complementaridade  entre  E  e  S  , no estado-de-transição .
     A  Figura 1  ilustra estas idéias  .  A desestabilização  de  ES  , em virtude da  energia de liga ~ ção  DGb ( por razões gráficas ,  D  está sendo usado  no lugar  do símbolo grego  delta  maiúscu-  lo , para denotar  incremento )  torna-se menos negativa  por  DGR .  DGR  resulta  no  aperfeiço-  amento  da  complementaridade, ou seja, melhor ajuste  entre  E  e  S , no estado-de-transição .
 Isto, em termos finais, resulta em aumento da velocidade da reação .


 
 

A teoria do estado – de transição leva, em enzimologia, a uma importante conclusão: uma enzima é tanto mais eficiente como catalisador, quanto ligar-se mais fortemente ao estado –de transição do que ao substrato livre, o que corresponde a uma maior complementaridade estrutural entre as sedes do centro ativo e as do estado – de – transição, relativamente ao substrato livre. Disto resulta a estabilização do estado – de –transição, com abaixamento da energia de ativação.
Esta  idéia é central na evolução, modificação e criação de novas enzimas. O conceito de complementaridade entre enzima e estado – de – transição foi desenvolvido por Pauling (1946), apesar de haver sido introduzido por Haldante, já em 1930. Em   catálise   enzimática   como   na catálise em geral, a energia – de – de ligação enzima – substrato é usada   em   grande   parte   na estabilização do estado – de – transição, baixando a energia – de – ativação com relação à mesma reação em ausência de catalisador. Isto  decorre do aperfeiçoamento da complementaridade entre centro ativo e substrato no estado – de transição. A parcela de energia livre (negativa) resultante das modificações geométricas no melhor ajuste do estado – de – transição reflete–se em aumento  da constante catalítica, a qual está relacionada à constante de velocidade   de   transformação  do complexo ensima – substrato (k2). A energia  da ligação de  E   e S  livre reflete-se no   valor   da constante de Michaelis (Km), que é, como se sabe, uma constante de dissociação para o complexo ES. As enzimas evoluem no sentido de aumentar a constante catalítica e diminuir  a   constante   de Michaelis ou seja, tendem a aumentar a constante de especificidade, que é o quociente da constante catalítica pela constante de Michaelis.
A utilização da energia –de ligação da formação do complexo enzima – substrato (ES) na catálise enzimática tem sido evidenciada por via experimental, principalmente   na   cinética   de   serino – proteases. O centro ativo  destas  enzimas  apresenta  várias   sedes  de   ligação  para   resíduos específicos da cadeia polipeptídica do substrato. É mostrado que a energia – de  - ligação é usada para  aumentar a constante de especificidade, Kcat/Km, tanto por aumento de  Kcat, como  na diminuiçã de Km.
A estrutura do estado – de – transição  em  reações enzimáticas, particularmente,  a   interface enzima/substrato, tem sido estudada em serino – proteases e  lisozima, por exemplo. O uso de análogos sintéticos, sugerido por Pauli (1946, 1948), tem-se  mostrado  uma  abordagem útil ao estudo do estado – de – transição e com aplicação na obtenção de sinzimas, particularmente de anticorpos catalíticos, como veremos adiante.
O estado – de transição, como esta denominação indica, é um estado transitório, com um tempo – de – vida muito curto, e o seu estudo exigee técnicas especiais, como as de cinética rápida ou ultra rápida, onde  são usados pulsos de laser e detectores sensíveis e de resposta rápida. Esta metodologia vem permitindo o estudo de dinâmica molecular,  formação, rompimento e distorção de ligações químicas, em tempos de 10-9  - 10-15  s .
Estas abordagens podem contribuir para o conhecimento da estrutura do estado de – transição de uma dada reação, sugerindo a síntese de análogos desse estado.
Análogos de substratos podem   ligar-se  ao  centro ativo das  respectivas  enzimas,   imitando  a formação de complexos de transição, sem que possa ocorrer a reação. É possível, então, o estudo da geometria do pseudo – complexo de transição, em condições convenientes.
A engenharia de proteínas consiste principalmente em mutação sítio-dirigida, resultando na substituição, supressão o adição de um determinado resíduo de uma regição funcional e de técnicas de DNA recombinante.
Assim, novas enzimas podem ser obtidas, as quais apresentam novas propriedades catalíticas e de estabilidade, ou enzimas podem ser modificadas para aperfeiçoamento de suas propriedades.

Apesar das esforços e avanços, o conhecimento atual é ainda insuficiente para previsões, com acurácia desejada, nas mudanças de  estrutura  tridimensional  da  proteína  e    das    respetivas modificações funcionais.
O aumento da termo- estabilidade de enzimas, sem muita ou nenhuma redução de atividade, tem sido estudado com vista à  aplicação industrial das enzimas modificadas.
Apesar de suas atuais limitações, a engenharia de enzimas mostra-se uma via válida e de futuro para alcançar a solução de vários problemas tecnológicos envolvendo a catálise biológica .
O progresso nas técnicas de síntese de polímeros ou oligômeros com atividade catalítica tem aberto o caminho para obtenção de enzimas artificiais – as  sinzimas (´´synzymes´´),  as   quais   seguem esquemas cinéticos análogos aos das enzimas naturais :  formação de   um   complexo   sinzima – substrato seguida de sua decomposição em sinzima – produtos, para o caso mais simples de apenas um substrato.
Em alguns casos, sinzimas são proteínas derivatizadas. Assim, ligando o complexo Ru(NH3) 3+ a três histidinas expostas em mioglobina que é uma proteína armazenadora de oxigênio no músculo, converte a função desta proteína na de uma oxidase, que é uma enzima que oxida ácido ascórbico e oxigêncio é reduzido.

A eficiência desta mioglobina derivatizada aproxima-se daquela da oxidase ascórbica natural.

Áciso poliglutâmico exibe exibe propriedades catalíticas, podendo funcionar como uma esterase, com atividade ótima em pH 5.3, Km = 2 x 10–3M e V = 10–4 a 10–5 S–1, para acetl – 4 nitro – fenol como substrato. Um outro interessante exemplo de enzima artificial é o da B – ciclo - dextrina , cuja derivação covalente da hidroxila – C6 por coenzima piridoxal ativado resulta em uma sinzima ativa com tranaminase, apesar da atividade mais baixa daquela da transaminase natural.

Apesar dos esforços dispendidos e de alguns avanços alcançados, não é ainda possível, no estado atual do conhecimento, projetar e obter Ab initio a síntese de enzimas funcionais. Este é um alvo ainda um tanto distante apesar de estar sendo aproximado à medida que avança a ciência das proteínas no sentido de predizer a estrutura tridimensional a partir de uma dada seqüência, assim como maior conhecimento das relações estrutura – função.

Anticorpos catalíticos Antígenos fazem com que o sistema imune produza protínas – os anticorpos que, com alta afinidade e especificidade, a eles se ligam, formando complexos antígeno – anticorpo ou imuno – complexos. A formação destes complexos constitui um dos exemplos mais ilustrativos da complementaridade interações moleculares como a base  do reconhecimento entre biomoléculas. Regiões das moléculas antigênicas – os epitopos são complementares de regiões dos respetivos anticorpos – os paratopos, apesar das interações não se restringirem a essas duas regiões. Análogos de estados – de transição, se conjugados covalentemente com proteínas, podem elicitar a formação de anticorpos pelo sistema imune, em um animal. Estes anticorpos apresentam paratopos que são complementares aos respectivos análogos de estado – de – transição contra os quais foram dirigidos, na seleção clonal. Desde que são diminutas as diferenças estruturais e de forma entre um estado – de – transição e o seu análogo, o anticorpo contra um dado análogo poderá combinar –se ao estado – de – transição correspondente, estabilizando –o por abaixamento de sua energia livre.

Isto é justamente o que faz uma enzima. Tem-se, assim, um anticorpo que pode funcionar como uma enzima – um anticorpo catalítico ou abzina. anticorpos catalíticos são obtidos em quantidade como anticorpos monoclonais, por  técnicas conhecidas.

A ação catalítica de abzimas, apesar de acelerar apreciavelmente as reações com relação às mesmas reações não catalisadas, é consideravelmente menor do que a das enzimas por razões indicadas anteriormente.

Abzimas são enzimas de baixa eficiÊncia catalítica, com muito baixo Km e baixa Vmax.

Pauling foi o primeiro a reconhecer que anticorpos poderiam reconhecer e estabilizar estados – de transição de reações, funcionando como enzimas.

a estratégia de usar análogos do estado – de – transição, tem sido usada também, para obter sinzimas por “impressão molecular “ (“molecular imprinting”). Polímeros sintéticos são polimerizados em presença de análogos de estados – de – transição, os quais formatam sedes complementares na matriz do polímero.

Catálise em síntese orgânica

As propriedades especiais das enzimas como catalisadores, tal como a excepcional seletividade, nas formas de estereorégio – e quimio-seletividade, têm estimulado, nos últimos anos, à aplicação de biocatálise em sínteses orgânicas onde tais propriedades especiais são vantajosas ou decisivas em determinadas sínteses. Nestes casos, os biocatalisadores competem ou mesmo superam outros catalisadores, como os usualmente disponíveis aos químicos orgânicos. Além da alta especificidade, a alta eficiência catalítica atinge taxas de aceleração de milhões a vários bilhões, em condições suaves de temperatura, pressão, pH e cominimização de reações secundárias indesejáveis. A hidroxilação de esteróides, por exemplo, é quimicamente um processo difícil, porém, o uso de hidroxilses de esteróides torna o processo possível em temperatura ambiente e com alta regloseletividade e total estéreo-seletividade.

UM outro exemplo, cuja expressão comercial é de alta significação, é o da produção de acrilamida, no Japão, com base na enzima hidrotase de nitrila, em temperatura de 10º C, com rendimento de 100% em acrilamida.

As vantagens sobre o processo químico, que usa cobre como catalisador são consideráveis. O processo enzimático é hoje dominante, não só pela escala de produção como pela pureza do produto obtido.

Final

Ao finalmente, após passar em vista, no nível de detalhe e extensão compatível com a natureza desta apresentação, alguns dos destaques no desenvolvimento da enzimologia. Ciência das Proteínas e enzimologia constituem o principal corpo facial e de idéias da Bioquímica Contemporânea.

Enzimas são a manifestação mais refinada da eficiência catalítica de importância biológica fundamental e ganhando, dia – a – dia, alcance tecnológico, com a tendência de aumento progressivo de aplicações em síntese orgânica, na indústria de produtos farmacêuticos e agroindústria.

Em biologia Fundamental, vê-se que as proteínas, em particular enzimas, respondem por processos – chave de transformação de espécies moleculares acumulação e transdução de energia livre, crescimento e multiplicação celular normal e anômalo, apoplose, transdução de sinais, morfogênese, regulação na expressão genômica, etc.

Não há exagero, portanto ao dizer-se que por trás de qualquer função biológica está sempre uma ou mais proteínas e quase sempre uma enzima.

Apesar de não ter tratado nesta exposição, da expansão do conceito de biocatalisador, não posso deixar de referir-me aos RNAs catalíticos – as ribozinas e DNAs catalíticos.

Propositadamente, optei por exclui-los, a despeito da alta importância que assumem em processos de grande significância para a célula viva.

Peço desculpas se, em algumas ocasiões, abusei de didaticismo. Deve ter ocorrido por força do viés por haver sido professor por tanto tempo.

Estou certo de que as contribuições trazidas a este seminário, representam contribuições significativas à tecnologia enzimática, faço votos para que assim seja.

Agradeço aos organizadores do seminário e, em particular, ao professor Carlos Roberto Felix, pela deferência do convite para que eu fizesse esta conferência.

Muito obrigado.

Manuel Mateus Ventura
07/04/2002


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