Por
Manuel Mateus Ventura
venturamm@unb.br
O início
Pasteur mostrou que as fermentações,
conhecidas como práticas artesanais para obtenção
de certos produtos como bebidas alcoólicas e vinagre, estavam
associadas à presença de microorganismos.
O trabalho pioneiro de Eduard Büchner (laureado
com o prêmio Nobel de 1907)(1), feito ao final do século
XIX e publicado em 1897 nos “Berichte der Deutschen Chemischen
Gesellschaft”, ao mostrar que fermentações
não passavam de ações
puramente químicas que podíam oicorrer
em meios livres de células, conduziu ao surgimento da
enzimologia – o estudo das enzimas, os
agentes químicos responsáveis por essas ações
fermentativas .
O trabalho de Büchner e o de Wöhler, este
de 1828 e reportando a síntese da uréia por termoisomerização
do isocianato de amônio, são marcos na linha de esforços
dos químicos no sentido de descrever e interpretar em termos
de química as transformações que ocorrem
na célula viva, vencendo, assim, a resistência vitalista
de boa parte do pensamento corrente da época. Os sistemas
vivos deixavam de ser intratáveis pelas leis universais
das ciências físicas, para serem considerados como
“sistemas altamente estruturados obedecendo às leis
da dinâmica química, no expressar de Lotka, em seus
Elements of Physical Biology (1924)¨ (2) ..
Delineara-se, assim, o surgimento da Bioquímica e da
Biofísica Molecular.
Enzimas como proteínas
catalíticas
A identificação subseqüente das
ensinas como proteínas dotadas de ação catalítica
fez com que o avanço da Enzimologia se fizesse imbricado
com a da ciência das proteínas e constituísse
o grosso das atividades em Bio -. química ao
mesmo tempo em que enzimas eram
isoladas, purificadas, cristalizadas e
caracterizadas. A identificação de substratos, inibidores,
ativadores e intermediários metabólicos conduzia
à definição das miríades de rotas
ou vias me metabólicas, cujo conjunto é hoje denominado
de metaboloma, seguindo a tendência da nomenclatura
atual em usar a desinência oma para designar grupos de espécies
e/ou ações moleculares que, na célula, apresentam
similaridade (genoma, proteoma, transcriptoma, metiloma, etc.).
Esta foi à fase de índole acentuadamente
reducionista da bioquímica, cujos conceitos, métodos
e resultados foram apresentados em um marco da literatura bioquímica
– o “Enzymes” de Haldane, publicado
em 1930.
Pela disrupção das células,
tornando seu conteúdo accessível aos procedimentos
de isolamento e de análise, a enzimologia pôde avançar
e constituir, sem dúvida, o corpo principal da bioquímica.
O rompimento de órgãos, tecidos e células,
como a etapa inicial das atividades em enzimologia,
incomodava aos biólogos
mais conservadores, pois, o bioquímico , alegavam
eles , destruía a organização biológica
característica do que era vivo, logo ao iniciar seu trabalho.
Entretanto, era óbvio, não havia outro meio de estudar
as enzimas e tudo mais relativo à estrutura e função
dos sistemas vivos, em nível mais fundamental – o
nível atômico – molecular.
As descrições fisiológicas,
conquanto válidas em seu
nível próprio de descrição,
não incluiam aspetos mecanísticos, eram
“caixas pretas.” , as quais a bioquímica
e a biofísica transformam
em “caixas brancas”, para usar denominações
do agrado das ciberneticistas.
Reunião e revisão
do conhecimento enzimológico
Duas obras monumentais reúnem e constituem
a fonte do conhecimento enzimológico de hoje:
– The Enzymes, em vários volumes,
editado por Boyer e outros;
– Methods in Enzymology, a mais extensa
obra de que se tem notícia relativamente a um domínio
de conhecimento. Anualmente, continua sendo acrescida por novos
volumes, os quais, como sabemos, são ansiosamente aguardados
pela comunidade bioquímica.
– Advances in Enzymology e Advances
in Protein Chemistry são, igualmente, úteis
publicações que, sob a forma de revisões,
reúnem tópicos de destaque da Enzimologia e da Ciência
das Proteínas.
-Bases de dados na WEB
Visão integrativa
Apesar de sua abordagem essencialmente analítica no estudo
do arsenal catalítico da célula viva, os bioquímicos,
e particularmente os enzimologistas, nunca ignoraram a necessidade
de, após os estudos in vitro, retornarem
ao interior da célula para o estudo das enzimas de forma
integrativa, ao seguir suas ações nas redes metabólicas,
sob mecanismos de controle de origem genômica e de sinalização
interna e externa.
Vale lembrar a declaração de Haldane, um
dos fundadores da Enzimologia, que sempre valeu como um alerta
aos bioquímicos:
“A célula não é um saco de enzimas".
Assim, por mais reducionistas que tivessem sido
em seu trabalho, os enzimologistos sempre tiveram presente
a idéia integrativa das ações enzimáticas
para entendimento das ações celulares e organísmicas.
Podemos dizer que esta é a tônica da bioquímica
e biofísica contemporâneas. Alguns se referem a uma
era pós-reducionista.
A enzimologia situa-se na interface Ciência da vida /
Ciências moleculares, recebendo da química e
da física conceitos , recursos teóricos e instrumentais
que lhe possibilitam consistência teórica e riqueza
metodológica que a permitem alcançar suas metas
fundamentais e de práxis. A tecnologia enzimática,
o tema central deste seminário, é a expressão
tecnocientífica desse domínio de conhecimento.
Purificação e cristalização
de enzimas
Para os estudos de caracterização
das enzimas são necessárias quantidades razoáveis
destas proteínas, da ordem de algumas dezenas de miligramas,
por exemplo.
Isto foi conseguido inicialmente por Summer
que cristalizou urease a partir de sementes de feijão
– de – porco (Cannavalia
ensiformus) .
A seguir, Northrop e Kunitz cristalizaram
pepsina, trypsina e quimotripsina.
A caracterização dessas enzimas fortaleceu
a idéia de que enzimas são proteínas catalíticas.
A cristalização de uma proteína
como critério de pureza cedeu lugar, por não ser
totalmente confiável, ao uso das técnicas eletroforéticas
em gel, de alto poder resolvente, como será visto mais
adiante.
Porém, a cristalização de proteínas
é sempre desejável, após suas purificações
serem levadas ao mais alto grau, visando-se o estudo das estruturas
por técnicas cristalográficas, como será
referido mais à frente.
Durante a primeira metade de século passado,
o “salting out” ou relargagem salina era a técnica
quase exclusiva no fracionamento e isolamento de proteínas
a partir dos extratos salinos de fontes de origem vegetal ou animal.
As proteínas séricas foram isoladas principalmente,
por “salting-out”. Dessa época, vêm
os termos albumina e globulima, atribuídos
a proteínas com base em seu comportamento frente a soluções
salimas e ainda hoje usados.
O surgimento das técnicas cromatográficas
em coluna, usando permutadores de íons (celuloses modificados
e resinas sintéticas) e géis para a filtração-
em- gel ( cromatografia – por – exclusão de
tamanho), é o marco de um avanço extraordinário
na metodologia de fracionamento e isolamento de proteínas
e, dentre estas, enzimas, mais particularmente.
A eletroforese em gel de poliacrilamida(PAGE), em
escala analítica ou preparativa, é ainda uma ferramenta
de uso quase obrigatório em química de proteínas.
A composição em aminoácidos
de proteínas purificadas tornou-se rotina por cromatografia
de permuta iônica, como resultado do magistral trabalho
de Stein e Moore que lhes valeu o prémio Nobel.
Tanto para fins de análise e preparação,
a química de proteínas contemporânea conta
com a cromatografia líquida de alta performance(LCHP),
como ferramenta altamente eficaz.
Proteínas purificadas têm sido clivadas
por ação de proteases de várias especificidades
e os peptídeos resultantes separados por técnicas
cromatográficas e eletroforéticas. Mapas peptídicos
por cromatografia – em – gel bidimensional mostram
alta resolução e têm importância na
identificação de proteínas e na obtenção
de peptídeos para ulterior sequenciamento de aminoácidos.
O sequenciamento dos peptídeos, iniciado
pelo trabalho de Sanger, é hoje feito por técnicas
cromatográficas em fase gasosa, automáticas, e,
cada vez com maior freqüência, por espectrometria –
de - massa,uma metodologia que se vem mostrando de grandes
recursos em química de proteínas. Hoje – em
– dia, dezenas de milhares de seqüências de proteínas,
das quais grande parte é de ensimas, estão disponíveis
em bases – de- dados, na WEB, juntamente com eficientes
ferramentas de software que permitem alinhamentos múltiplos
construção de árvores filogenéticas
e comparações para definição de domínios
conservados e outras operações tornadas possíveis
pela crescente metodologia bioinformática. Todo esse acervo
informacional está disponível aos pesquisadores,
usando microcomputadores ou “workstations”, em seus
gabinetes de trabalho ou em suas residências.
A publicação de seqüências
de proteínas veio a tornar-se tão rotineiro que
se deslocou para periódicos de menor índice de impacto,
ou simplesmente depositadas as seqüências em bases
de dados. Desde que o sequenciamento de DNA é mais simples
do que o de proteínas, a seqüência de um
gene estrutural pode ser traduzida e dar uma primeira informação
sobre a seqüência da proteína por ele
codificado. E claro que isto não dá conta de modificações
pós e co-traducionais, as quais são por vezes cruciais
para o funcionalidade da proteína.
Christian Anfinsen e colaboradores, na década
de 50, mostraram que a seqüência de aminoácidos
de uma proteína possui toda a informação
necessária ao dobramento da proteína em sua estrutura
tridimensional nativa, funcional, A enzima ribonuclease foi totalmente
desenrolada à sua estrutura desnaturada inativa, inclusive
com suas ligações-dissulfeto rompidas, e, a seguir,
re-enrolada e sua atividade restaurada.
Entretanto, ir da seqüência à estrutura nativa,
tridimensional, isto é, conhecer o chamado 2º código,
é um grande problema e de solução ainda remota,
apesar dos grandes esforços despendidas por mentes brilhantes,
nos dias de hoje.
A funcionalidade das proteínas decorre de
suas estruturas terciárias ou tridimensionais. O problema
biológico central do reconhecimento entre moléculas,
proteína – proteína, proteína –
ácido nucléico, enzima – substratos, coenzimas,
inibidores e ativadores, enfim, proteína –
ligantes é, essencialmente, um problema de
complementaridade entre as regiões de contato, onde ocorrem
as interações de ligação, como já
vimos atrás.
Em virtude da plasticidade estrutural das proteínas,
as interações nas superfícies de contato
não se restringem aos resíduos de aminoácidos
diretamente envolvidos, mas podem propagar-se a regiões
afastadas das sedes – de – ligação.
Estas transconformações, chamadas de transições
alostéricas, explicam modificações
e regulações alostéricas em enzimas.
Muitas proteínas apresentam estrutura quaternária
, a qual consiste na associação de sub-unidades,
isto é, na formação de oligômeros.
Em alguns casos, sedes – de – ligação
resultam de dimerizações, sendo formadas por resíduos
de aminoácidos pertencentes às duas sub-unidades
associadas.
Vemos, assim, que a grande meta a ser alcançada
no estudo de proteínas, inclusive o subconjunto das
enzimas, é o conhecimento de suas estruturas, em nível
atômico , suas funções e, consequentemente,
as relações estrutura – função,
as quais, à medida que se tornam conhecidas, formam a base
que torna possível modificar deliberada - mente suas
estruturas para modificar ou mesmo criar novas propriedades.
Esquematicamente, no estado atual da ciência
das proteínas, o estudo estrutural de uma proteína
segue, geral -
mente, as seguintes etapas :
– Estrutura primária, usando-se cada vez mais
espetrometria – de – massa;
– Estrutura secundária, via espetrometria
dicroíca (dicroísmo circular) e espectrometria infravermelha
com transformada de Fourier (FTIR);
– Estrutura terciária ou tridimensional estudada
por cristalografia de raio – X, e/ou , em solução,
por ressonância magnética nuclear (NMR) .
Cristalografia de raio - X
Cristalografia de raio-X consiste
no estudo difratométrico de cristais de proteína
, os quais devem ser bem formados e de tamanho adequado . Nesta
poderosa metodologia, a cristalização da proteína
é a etapa limitante em termos de tempo e sucesso, apesar
de sua crescente automação . Algumas proteínas
são de difícil ou mesmo impossível cristalização
.
Em casos especiais, a difração de neutrons , em
lugar da de raio – X, é usada para serem
obtidas as posições dos átomos de H,
o que não é possível com raio – X.
O uso recente de linhas de radiação- X de alta intensidade
em laboratórios de luz síncrotron está contribuindo
para aperfeiçoar a obtenção de dados de difração
, os quais são processados em linha com computadores digitais
até os mapas de densidade eletrônica , á modelagem
final e ao refinamento dos modelos obtidos, podendo seguir-se
a avaliação da qualidade destes e deposição
em banco de estruturas ( PDB ) .
Recentemente (NATURE, 10 JAN 2002), estão sendo
usados lasers de eletron livre ( FEL), para emissão
de pulsos breves e intensos de raio – X que seriam
muito mais eficazes do que a radiação do síncrotron
em explorar a estrutura de macromoléculas biológicas,
em nível atômico. Espera-se, para os próximos
anos, lasers de eletron livre que produzam pulsos de raio –
X milhões de vezes mais intensos do que os emitidos
pelas fontes já em uso.
O revolucionário é que, com esses pulsos rápidos
e muito intensos de raio – X, seria possível determinar
a estrutura de biomacromolécular individuais (“single
molecules”) ou de pequeno número delas .
O estudo de moléculas individuais ou isoladas teria, entre
outras vantagens, a de ter a molécula livre dos constrangimentos
que ocorrem em um cristal.
Esses estudos estão baseados em dois grandes centros:
- Centro de Pesquisa em Física de Altas –
Energias da Alemanha, Hamburgo;
- Centro do Acelerador Lineais de S’tanford (SLAC), California
( www.slac.stanford.edu ) .
Referindo-nos aos métodos de cristalografia
de raio – X - sem dúvida o maior destaque na
ciência das proteínas ou, de um
modo mais amplo, na biologia estrutural, não podemos deixar
de falar, mesmo de passagem, do trabalho pioneiro dos que deram
partida a esse domínio de conhecimento.
Toda a cristalografia de raio – X, como a
temos hoje, originou-se no Laboratório Cavendish
, Cambridge, Inglaterra, quando, em1934, J.D. Bernal e Doroth
Crowfoot (mais trade Hodgkin), surpreendentemente obtiveram um
padrão de difração ao fazerem incidir um
feixe de raio – X sobre um cristal de pepsina. Este resultado
opunha-se ao ponto de vista de que as proteínas eram colóides
de estrutura amorfa, aleatória. Este modo de ver
a estrutura das proteínas era defendido pela prestigiosa
escola alemã de química orgânica liderada
por Willstätter.
Ao trabalho de Bernal e Crowfoot seguiram-se,
ainda no Laboratório Cristalográfico de Cambridge,
os estudos de Max Perutz e John Kendrew, sobre a estrutura por
difração de raio-X da hemoglobina e mioglobina,
respetivamente.
Após um contato com Haurowitz, em Praga,
em fins de 1931 e após receber de Adair cristais de hemoglobina
e ter recebido de Bernal e Fankuchen as primeiras lições
sobre como obter padrões de difração de raio
– X, Perutz deu partida ao seu épico e seminal trabalho
sobre a estrutura molecular da hemoglobina, em Cambridge.
No início de 1938, publicou com Bernal, Fankuchen, em Nature
[141 (1938) 523], um trabalho sobre difração de
raio – X de cristais de hemoglobina e quimotripsina.
Perutz e Kendrew(3) repartiram o prêmio Nobel de 1962.
Kendrew, a quem tive o prazer de conhecer pessoalmente em uma
reunião no Instituto de Biofísica, UFRJ, faleceu
em 1997, aos 80 anos.
Perutz faleceu em fevereiro passado, aos 87 anos (4) .
Perutz ocupou-se do estudo da hemoglobina por praticamente toda
a sua vida científica, desde seu primeiro e
magistral trabalho sobre a estrutura tridimensional dessa proteína
(5) . A hemoglobina, como se sabe, é uma hemoproteína
tetramérica que transporta oxigênio dos pulmões
aos músculos , onde, então, é estocado em
li-
gação com mioglobina . Além disso, toma parte
no transporte de CO2 e na regulação do pH sangüíneo.
Seu
mecanismo regulador da ligação e dissociação
de oxigênio é um dos primeiros casos de alosteria
a ser estudado.
Apesar de não ser uma enzima, hemoglobina foi considerada
por Wyman como uma ´enzima honorária ´, por
serem suas características regulatórias, basucamente.
apresentadas em enzimas alostéricas .
As mais de 15000 estruturas cristalográficas de proteínas
depositadas no Banco de Dados de Proteínas (PDB),
o qual é continuamente acrescido, são um monumento
a todos os cristalógrafos que contribuíram e contribuem
com o seu trabalho e que são portadores do espírito
dos que começaram no laboratório de cristalografia
de Cambridge – o berço da Biologia Molecular.
Ressonância magnética nuclear
( RMN )
Pequenas e médias proteínas,
quando refratárias à cristalização,
têm tido suas estruturas tridimensionais estudadas por ressonância
magnética nuclear, em solução . Esta poderosa
metodologia tem sido de extraordinária importância
no estudo da estrutura de moléculas orgânicas , inclusive
macromoléculas de interesse biológico , com peptídeos,
proteínas ( pequenas ou de tamanho médio ) e ácidos
nucleicos. As limitações decorrentes do tamanho
da proteína vêm sendo afastadas com aperfeiçoamentos
técnicos e novas estratégias metodológicas
. Estudos de dinãmica molecular têm sido feitos
com essa ténica, contribuindo para esclarecer importantes
aspetos da relação estrutura-função
.
Ao serem superadas as limitações instrumentais,
pricipalmente pelo uso de supercondutores , permitindo obter fortes
campos magnéticos , e a perspectiva de desenvovimento de
avançados sistemas de detecção, RMN
de biomacromoléculas tornou-se possível .e torna-se
cada vez mais potente.
Proteômica : técnicas de larga escala
( ´´ high throughput´´)
Por força dos projetos de genômica
funcional e de proteômica, as técnicas
estão sendo ajustadas no sentido de darem conta de grande
número de amostras, ao mesmo tempo que os resultados obtidos
são processados e interpretados em forma integrada, passando
a constituir o acervo de grandes bases – de – dados,
acessáveis na rede mundial de informação
por adequadas ferramentas software.
Esses dados estão servindo a importantes projetos nas áreas
das tecnologias enzimática, médico – farmacêutica
e agrária, com a idéia de “high threoughput”,
i.e. ,de larga escala , para permitir resultados
em volume e tempo adequados .
Ainda nesse sentido, tem-se a destacar a “hifenação´´
de técnicas analíticas, ou seja, o uso de duas ou
mais técnicas em sucessão. Cromatografia líquida
seguida , em linha, de espectrometria – de massa,
por exemplo.
Catálise enzimática
A idéia de que a ação enzimática
envolve a etapa inicial de formação de um complexo
enzima – substrato, introduzida ao início do
século XX por Henri e Brown, tornou-se central em enzimologia,
passando a ser básica nos modelos cinéticos e em
considerações mecanísticas.
A corrente de pensamento que admitia a ligação
do substrato, efectores e modificadores restrita a
uma região delimitada da enzima – o centro ativo,
com interações limitadas aos resíduos e grupos
específicos a que se ligam (as sedes de ligação)
ou são diretamente envolvidos na ação
catalítica (sedes catalíticas), cedeu lugar
a tentativas de interpretação mais dinâmica
.
Aquela visão estática foi ilustrada pelo clássico
modêlo da “fechadura-e- chave” de Emil
Fischer para representar o reconhecimento e o encaixe seletivo
na interação enzima – substrativo, dos
quais resulta a formação do complexo ES .
Enzima como uma molécula
dinâmica
Essa complementaridade perfeita entre o centro ativo
da enzima e o substrato, como se fosse uma peça a encaixar-se
em um quebra-capeça, foi considerada menos rigida
por Koshland, ao propor seu modelo de “induced fit”,
isto é, mesmo que a conformação do centro
ativo não preexista como perfeitamente complementar do
substrato, este, ao interagir com a enzima, pode induzir modificações
conformacionais que orientem adequadamente os grupos de ligação
e catalíticos com relação ao substrato. Então,
o substrato pode moldar sua sede, interagindo com
os grupos específicos do centro ativo,
de modo a otinizar seu encaixe. Além disso,
as modificações conformacionais, isto é,
os movimentos ou deslocamentos de átomos ou
grupos atômicos determinados pela interação
com o substrato ou modificadores, podem propagar-se através
da matriz proteica e influenciar pontos afastados do centro ativo.
Isto é tornado possível pala plasticidade da molécula
de proteína, resultando em movimentos
relativos de grupos atômicos e cadeias laterais dos resíduos
.
A visualização da estrutura de uma proteína
a partir das coordenadas de seus átomos as quais foram
obtidas por cristalografia de raio – X, é um instantâneo,
não refletindo a natureza dinâmica da molécula
real.
A idéia de uma molécula de proteína dinâmica,
flutuante, com movimentos internos, tem
sido fortalecida por um corpo de dados experimentais desde Lindeström
– Lang (1954), com os primeiros trabalhos sobre a permuta
de H/D em soluções aquosas
de proteínas..
A molécula de proteína
como uma população de confórmeros
Nos últimos dois anos, usando coleções
combinatoriais de ligantes, tem sido observado, surpreendentemente,
que proteínas de especificidade não muito restrita
podem ligar-se, por vezes com maior afinidade, a ligantes que
diferem, em composição, tamanho e forma, dos seus
ligantes naturais.
Esta multiplicidade de ligantes para uma mesma sede de ligação
está sendo explicada vendo a molécula
de proteína como uma população de confórmeros
de energias livres próximos uma da outra e em torno do
estado nativo. Esses confórmeros são supostos em
equilíbrio, o qual pode ser deslocado por fatores físico-químicos
do meio e/ou por interação com ligantes.
Assim, se um dos confórmero tiver maior afinidade por um
determinado ligante, o equilíbrio será deslocado
em favor desse confórmero, com o conseqüente aumento
de concentração do complexo correspondente. A sede
para um ligante já existiria em um confórmero na
população típica da proteína considerada.
Lembraria, aproximadamente, o que ocorre no reconhecimento e interação
antígeno – anticorpo, O anticorpo adequado ao antígeno
preexiste e sua ligação ao antígeno determina
a biossíntese desse antícorpo, no mecanismo
descrito pela teoria da seleção clomal.
A consideração de proteínas,
em particular enzimas, como sistemas moleculares altamente dinâmicos,
é o pensamento hoje dominante em ciência das proteínas.
Entretanto, os estudos experimentais sobre dinâmica
de proteínas são de realização difícil,
exigindo técnicas, geralmente espectrométricas,
inclusive as de cinética ultra-rápida ( de nano
a femtossegundo ) que flagrem, não só eventos
locais como globais da molécula em estudo.
A ampla escala- de- tempo
As simulações com auxílio de
computador encontram dificuldade na larga faixa de
variação da escala de tempo dos eventos envolvidos,
na faixa de picossegundo a segundo. As simulações
de dinâmica molecular, mesmo com o auxílio de computadores
poderosos, têm alcançado apenas centenas de nanossegundos
e, excpecionalmente um microssegundo, neste caso para uma molécula
relativamente pequena. Isso fica longe d o que seria
necessário para simular o dobramento
e os movimentos de regiões ou domínios de proteínas.
Estão sendo feitos esforços para fortalecer
o arcabouço teórico
que servirá de base
à interpretação das situações
e dos resultados experimentais sobre a dinâmica molecular,
o que constitui a essência da expressão
funcional de proteínas e, em particular, de enzimas.
O estado-de-transição
A teoria de processos que evoluem no tempo, isto
é, caracterizados por uma cinética – os “
rate processes”, que, apesar de desenvolvida inicialmente
para sistemas reacionantes em fase gasosa (teoria das velocidades
absolutas de reação), foi estendida a precessos
em fase condensada, a despeito das dificuldades encontradas
pelos teóricos. Esta teoria, desenvolvida por Eyring e
outros na década de 30, no século passado, admite,
como idéia básica, que uma reação
química passa em seu curso, necessariamente pela formação
de um agregado molecular dos reagentes – o chamado estado-
de- transição. Neste estado, as espécies
moleculares interagentes são estruturalmente distorcidas,
possibilitando o rompimento e a formação de novas
ligações covalentes, dando lugar, assim,
à conversão em produtos da reação.
O estado – de – transição é
um estado de alta energia livre (Gibbs) – a energia de
ativação, uma barreira de energia a ser ultrapassada
para que ocorra a conversão de reagentes em produtos. Mais
alta a energia livre de ativação, menor será
a probabilidade do sistema evoluir de reagentes a produtos e,
portanto, mais lenta a reação. São tais barreiras
de energia responsáveis pela maior ou menor estabilidade
das moléculas.
Os agentes que estabilizam o estado – de – transição,
o que ocorre por abaixamento de sua energia livre com relação
aos reagentes, aceleram as respetivas reações. Se
tais agentes são regenerados ao fim da reação,
são então chamados de catalisadores. Os catalisadores
exercem sua ação por formação de um
complexo com os reagentes no estado de transição.
De passagem, é oportuno lembrar que o estado – de
transição em reações enzimáticas
não é o complexo enzima – substrato, tipo
Michaelis – Menten. O estado- de- transição,
ES* , de muito breve tempo de vida, segue-se
ao complexo enzima-substrato , ES .
A teoria dos “rate processes” constitui
a base cinética da biologia molecular (Eyring
e outros, 1954), tomada esta em sentido amplo –
a do entendimento da estrutura e função dos
biossistemas em nível atômico – molecular.
Parece claro que a proximidade e orientação
dos grupos atômicos envolvidos
em reações intramoleculares ou enzimáticas
são fatores que contribuem para o aumento de velocidade
de re -
ação, relativamente aos processos onde essas condições
não ocorrem.
Na formação do complexo
enzima-substrato, ES , há redução entrópica
por conta da imobi= lização do substrato
no centro ativo, i.e., por diminuição dos
graus de liberdade do substrato.
Em alguns casos, o alojamento do substrato no centro ativo resulta
na expulsão de moléculas de
água para o corpo do solvente, onde assumem estado
mais desordenado .Neste caso, tem-se aumento entrópico
, resultando um processo promovido ou impulsionado por entropia,
se a magni- tude do termo entrópico da energia
livre de Gibbs for maior do que o termo entálpico
(positivo).
O estado de transição resulta do complexo
ES por distorção da geometria
do substrato e da
enzima, a qual resulta no rompimento e formação
de ligações covalentes, o que leva à formação
de
produtos e à regeneração da enzima,
no ciclo da reação .
A interação do substrato S com a
enzima E no estado-de-transição , i.e.,
a interação de S* e E para formar ES*
, resulta em decréscima de entalpia e os efeitos
entrópicos são de tal magnitude
que se tem abaixamento da energia livre e estabilixação
do complexo ES* .
A teoria dos ´´rate processes´´ constitui
a base cinética da biologia
molecular (Eyring e outros, 1954), tomada esta em
seu sentido amplo - o do entendimento da estrutura e função
dos biossis -
temas , em nível atômico-molecular (11)..
A proposta de Pauling
Pauling, em 1946, propôs que
uma enzima é tanyo mais eficiente como
catalisador, quanto ligar-se mais fortemente ao
substrato no estado-de-transição ( S* ) do
que ao substrato livre ( S ), o que corresponde a uma complementaridade
estrutural entre as sedes de ligação da enzima
e S*. Disto resulta a estabilização
do estado-de-transição, com abaixamento da energia
de ativação (12, 13) . Esta idéia tem dominado
a enzimologia e é central na evolução,
modificaão e na criação
de novas enzimas . O conceito de complementaridade entre
enzima e substrato no estado-de-transi -
ção , apesar de proposto por Pauling (1946) , foi
introduzido por Haldane, já em 1930 .
Em catálise enzimática, como na catálise
em geral, a energia de ligação enzima-substrato
é usada,
em grande parte, para estalilizar o estado-de-transução
. A parcela nrgativa de energia livre resul- tante das modificações
geométricas, quando do melhor ajuste do estado-de-transição
, reflete-se em aumento da constante
catalítica , kcat , A energia de ligação
entre a enzima e o substrato livre reflete-se no valor
da contante de Michaelis ( KM ) , que é,
com se sabe, a contante de dissocia - ção
do complexo ES , sob determinadas condições
. As enzimas evoluem no sentido de aumentar KM
, i.e, no sentido de uma maior dissociabilidade do complexo enzima-substrato
, o que se opõe ao que geralmente é aceito
, que uma ligação mais forte entre enzima e substrato
seria mais favorá- vel à catálise
.
A utilização, na catálise
enzimática, da energia de ligação entre
enzima e substrato, tem sido evidenciada
por via experimental, principalmente na cinética
de serino-proteases .O centro centro ativo destas
enzimas apresenta várias sedes de ligação
para resíduos específicos da cadeia
poli- peptídica do substrato . É
mostrado que a energia de ligação entre
E e S é usada em aumen- tar
a constante de especificidade , kcat /
KM , por acréscimo de kcat
, como conseqüência da melhor complementaridade
entre E e S , no estado-de-transição
.
A Figura 1 ilustra estas idéias
. A desestabilização de ES
, em virtude da energia de liga ~ ção
DGb ( por razões gráficas , D
está sendo usado no lugar do símbolo
grego delta maiúscu- lo , para denotar
incremento ) torna-se menos negativa por DGR
. DGR resulta no aperfeiço-
amento da complementaridade, ou seja, melhor
ajuste entre E e S , no estado-de-transição
.
Isto, em termos finais, resulta em aumento da velocidade
da reação .
A teoria do estado – de transição
leva, em enzimologia, a uma importante conclusão: uma enzima
é tanto mais eficiente como catalisador, quanto ligar-se
mais fortemente ao estado –de transição do
que ao substrato livre, o que corresponde a uma maior complementaridade
estrutural entre as sedes do centro ativo e as do estado –
de – transição, relativamente ao substrato
livre. Disto resulta a estabilização do estado –
de –transição, com abaixamento da energia
de ativação.
Esta idéia é central na evolução,
modificação e criação de novas enzimas.
O conceito de complementaridade entre enzima e estado –
de – transição foi desenvolvido por Pauling
(1946), apesar de haver sido introduzido por Haldante, já
em 1930. Em catálise enzimática
como na catálise em geral, a energia –
de – de ligação enzima – substrato é
usada em grande parte
na estabilização do estado – de – transição,
baixando a energia – de – ativação com
relação à mesma reação em ausência
de catalisador. Isto decorre do aperfeiçoamento da
complementaridade entre centro ativo e substrato no estado –
de transição. A parcela de energia livre (negativa)
resultante das modificações geométricas no
melhor ajuste do estado – de – transição
reflete–se em aumento da constante catalítica,
a qual está relacionada à constante de velocidade
de transformação do complexo ensima
– substrato (k2). A energia da ligação
de E e S livre reflete-se no
valor da constante de Michaelis (Km), que é,
como se sabe, uma constante de dissociação para
o complexo ES. As enzimas evoluem no sentido de aumentar a constante
catalítica e diminuir a constante
de Michaelis ou seja, tendem a aumentar a constante de especificidade,
que é o quociente da constante catalítica pela constante
de Michaelis.
A utilização da energia –de ligação
da formação do complexo enzima – substrato
(ES) na catálise enzimática tem sido evidenciada
por via experimental, principalmente na
cinética de serino – proteases.
O centro ativo destas enzimas apresenta
várias sedes de ligação
para resíduos específicos da cadeia
polipeptídica do substrato. É mostrado que a energia
– de - ligação é usada para
aumentar a constante de especificidade, Kcat/Km, tanto por aumento
de Kcat, como na diminuiçã de Km.
A estrutura do estado – de – transição
em reações enzimáticas, particularmente,
a interface enzima/substrato, tem sido estudada em
serino – proteases e lisozima, por exemplo. O uso
de análogos sintéticos, sugerido por Pauli (1946,
1948), tem-se mostrado uma abordagem útil
ao estudo do estado – de – transição
e com aplicação na obtenção de sinzimas,
particularmente de anticorpos catalíticos, como veremos
adiante.
O estado – de transição, como esta denominação
indica, é um estado transitório, com um tempo –
de – vida muito curto, e o seu estudo exigee técnicas
especiais, como as de cinética rápida ou ultra rápida,
onde são usados pulsos de laser e detectores sensíveis
e de resposta rápida. Esta metodologia vem permitindo o
estudo de dinâmica molecular, formação,
rompimento e distorção de ligações
químicas, em tempos de 10-9 - 10-15
s .
Estas abordagens podem contribuir para o conhecimento da estrutura
do estado de – transição de uma dada reação,
sugerindo a síntese de análogos desse estado.
Análogos de substratos podem ligar-se
ao centro ativo das respectivas enzimas,
imitando a formação de complexos de transição,
sem que possa ocorrer a reação. É possível,
então, o estudo da geometria do pseudo – complexo
de transição, em condições convenientes.
A engenharia de proteínas consiste principalmente em mutação
sítio-dirigida, resultando na substituição,
supressão o adição de um determinado resíduo
de uma regição funcional e de técnicas de
DNA recombinante.
Assim, novas enzimas podem ser obtidas, as quais apresentam novas
propriedades catalíticas e de estabilidade, ou enzimas
podem ser modificadas para aperfeiçoamento de suas propriedades.
Apesar das esforços e avanços, o conhecimento
atual é ainda insuficiente para previsões, com acurácia
desejada, nas mudanças de estrutura tridimensional
da proteína e das
respetivas modificações funcionais.
O aumento da termo- estabilidade de enzimas, sem muita ou nenhuma
redução de atividade, tem sido estudado com vista
à aplicação industrial das enzimas
modificadas.
Apesar de suas atuais limitações, a engenharia de
enzimas mostra-se uma via válida e de futuro para alcançar
a solução de vários problemas tecnológicos
envolvendo a catálise biológica .
O progresso nas técnicas de síntese de polímeros
ou oligômeros com atividade catalítica tem aberto
o caminho para obtenção de enzimas artificiais –
as sinzimas (´´synzymes´´),
as quais seguem esquemas cinéticos
análogos aos das enzimas naturais : formação
de um complexo sinzima –
substrato seguida de sua decomposição em sinzima
– produtos, para o caso mais simples de apenas um substrato.
Em alguns casos, sinzimas são proteínas derivatizadas.
Assim, ligando o complexo Ru(NH3) 3+ a três histidinas expostas
em mioglobina que é uma proteína armazenadora de
oxigênio no músculo, converte a função
desta proteína na de uma oxidase, que é uma enzima
que oxida ácido ascórbico e oxigêncio é
reduzido.
A eficiência desta mioglobina derivatizada
aproxima-se daquela da oxidase ascórbica natural.
Áciso poliglutâmico exibe exibe propriedades
catalíticas, podendo funcionar como uma esterase, com atividade
ótima em pH 5.3, Km = 2 x 10–3M e V = 10–4
a 10–5 S–1, para acetl – 4 nitro – fenol
como substrato. Um outro interessante exemplo de enzima artificial
é o da B – ciclo - dextrina , cuja derivação
covalente da hidroxila – C6 por coenzima piridoxal ativado
resulta em uma sinzima ativa com tranaminase, apesar da atividade
mais baixa daquela da transaminase natural.
Apesar dos esforços dispendidos e de alguns
avanços alcançados, não é ainda possível,
no estado atual do conhecimento, projetar e obter Ab initio a
síntese de enzimas funcionais. Este é um alvo ainda
um tanto distante apesar de estar sendo aproximado à medida
que avança a ciência das proteínas no sentido
de predizer a estrutura tridimensional a partir de uma dada seqüência,
assim como maior conhecimento das relações estrutura
– função.
Anticorpos catalíticos Antígenos fazem
com que o sistema imune produza protínas – os anticorpos
que, com alta afinidade e especificidade, a eles se ligam, formando
complexos antígeno – anticorpo ou imuno – complexos.
A formação destes complexos constitui um dos exemplos
mais ilustrativos da complementaridade interações
moleculares como a base do reconhecimento entre biomoléculas.
Regiões das moléculas antigênicas –
os epitopos são complementares de regiões dos respetivos
anticorpos – os paratopos, apesar das interações
não se restringirem a essas duas regiões. Análogos
de estados – de transição, se conjugados covalentemente
com proteínas, podem elicitar a formação
de anticorpos pelo sistema imune, em um animal. Estes anticorpos
apresentam paratopos que são complementares aos respectivos
análogos de estado – de – transição
contra os quais foram dirigidos, na seleção clonal.
Desde que são diminutas as diferenças estruturais
e de forma entre um estado – de – transição
e o seu análogo, o anticorpo contra um dado análogo
poderá combinar –se ao estado – de –
transição correspondente, estabilizando –o
por abaixamento de sua energia livre.
Isto é justamente o que faz uma enzima. Tem-se,
assim, um anticorpo que pode funcionar como uma enzima –
um anticorpo catalítico ou abzina. anticorpos catalíticos
são obtidos em quantidade como anticorpos monoclonais,
por técnicas conhecidas.
A ação catalítica de abzimas,
apesar de acelerar apreciavelmente as reações com
relação às mesmas reações não
catalisadas, é consideravelmente menor do que a das enzimas
por razões indicadas anteriormente.
Abzimas são enzimas de baixa eficiÊncia
catalítica, com muito baixo Km e baixa Vmax.
Pauling foi o primeiro a reconhecer que anticorpos
poderiam reconhecer e estabilizar estados – de transição
de reações, funcionando como enzimas.
a estratégia de usar análogos do estado
– de – transição, tem sido usada também,
para obter sinzimas por “impressão molecular “
(“molecular imprinting”). Polímeros sintéticos
são polimerizados em presença de análogos
de estados – de – transição, os quais
formatam sedes complementares na matriz do polímero.
Catálise em síntese
orgânica
As propriedades especiais das enzimas como catalisadores,
tal como a excepcional seletividade, nas formas de estereorégio
– e quimio-seletividade, têm estimulado, nos últimos
anos, à aplicação de biocatálise em
sínteses orgânicas onde tais propriedades especiais
são vantajosas ou decisivas em determinadas sínteses.
Nestes casos, os biocatalisadores competem ou mesmo superam outros
catalisadores, como os usualmente disponíveis aos químicos
orgânicos. Além da alta especificidade, a alta eficiência
catalítica atinge taxas de aceleração de
milhões a vários bilhões, em condições
suaves de temperatura, pressão, pH e cominimização
de reações secundárias indesejáveis.
A hidroxilação de esteróides, por exemplo,
é quimicamente um processo difícil, porém,
o uso de hidroxilses de esteróides torna o processo possível
em temperatura ambiente e com alta regloseletividade e total estéreo-seletividade.
UM outro exemplo, cuja expressão comercial
é de alta significação, é o da produção
de acrilamida, no Japão, com base na enzima hidrotase de
nitrila, em temperatura de 10º C, com rendimento de 100%
em acrilamida.
As vantagens sobre o processo químico, que
usa cobre como catalisador são consideráveis. O
processo enzimático é hoje dominante, não
só pela escala de produção como pela pureza
do produto obtido.
Final
Ao finalmente, após passar em vista, no nível
de detalhe e extensão compatível com a natureza
desta apresentação, alguns dos destaques no desenvolvimento
da enzimologia. Ciência das Proteínas e enzimologia
constituem o principal corpo facial e de idéias da Bioquímica
Contemporânea.
Enzimas são a manifestação
mais refinada da eficiência catalítica de importância
biológica fundamental e ganhando, dia – a –
dia, alcance tecnológico, com a tendência de aumento
progressivo de aplicações em síntese orgânica,
na indústria de produtos farmacêuticos e agroindústria.
Em biologia Fundamental, vê-se que as proteínas,
em particular enzimas, respondem por processos – chave de
transformação de espécies moleculares acumulação
e transdução de energia livre, crescimento e multiplicação
celular normal e anômalo, apoplose, transdução
de sinais, morfogênese, regulação na expressão
genômica, etc.
Não há exagero, portanto ao dizer-se
que por trás de qualquer função biológica
está sempre uma ou mais proteínas e quase sempre
uma enzima.
Apesar de não ter tratado nesta exposição,
da expansão do conceito de biocatalisador, não posso
deixar de referir-me aos RNAs catalíticos – as ribozinas
e DNAs catalíticos.
Propositadamente, optei por exclui-los, a despeito
da alta importância que assumem em processos de grande significância
para a célula viva.
Peço desculpas se, em algumas ocasiões,
abusei de didaticismo. Deve ter ocorrido por força do viés
por haver sido professor por tanto tempo.
Estou certo de que as contribuições
trazidas a este seminário, representam contribuições
significativas à tecnologia enzimática, faço
votos para que assim seja.
Agradeço aos organizadores do seminário
e, em particular, ao professor Carlos Roberto Felix, pela deferência
do convite para que eu fizesse esta conferência.
Muito obrigado.
Manuel Mateus Ventura
07/04/2002